Le premier noyau des musées et galeries du Vatican était une collection de sculptures anciennes créée par Jules II (1503-13). L'idée du musée a été conçue par Clément XIII (1758-69), qui a créé le Profane Museum avec l'aide de Winckelmann. Le Musée Clément Pieux fut créé par Clément XIV (1769-1774) et Pieux Six (1775-1799) et le Musée Chiaramonti fut créé par Canova en 1807-1810 sous Pieux VII. En 1822, la nouvelle aile fut ouverte. Le musée étrusque grégorien a ouvert ses portes en 1837 et le musée égyptien grégorien en 1839, le musée profane du Latran (aujourd'hui musée grégorien profane) et successivement le musée pieux chrétien, tous placés sous Grégoire XVI. Au cours des premières décennies du XXe siècle, le musée ethnologique missionnaire a été créé et la galerie d'images a été ouverte au public. En 1973, Paul VI inaugure le musée historique et la collection d'art religieux moderne.

Musée de la clémentine - Il rassemble des spécimens de sculptures antiques telles que l'Apollon du Belvédère (130-140 après JC), le Groupe de Laocoon (premier siècle après JC), l'Apollon Sauroktonos et le Vénus Cnydia, la tête colossale de Jupiter. Les deux sarcophages en porphyre de Constance et de Sainte Hélène, respectivement fille et mère de Constantin, présentent un intérêt particulier.

Musée Chiaramonti - Il abrite plusieurs sculptures romaines, telles que la statue de Ganymède, une tête colossale d'Athéna, un portrait de Tibère, un relief avec les Trois Grâces (premier siècle de notre ère. ). De nombreuses inscriptions païennes et chrétiennes sont exposées dans la Galleria Lapidaria et des statues telles que l'Amazone blessée, le Lancier, l'énorme statue du Nil et l'Auguste de Prima Porta sont exposées dans la Nouvelle Aile.

Musée Grégorien étrusque - Il contient plusieurs découvertes provenant principalement de fouilles du XIXe siècle réalisées dans le sud de l'Étrurie, telles que le trousseau de la tombe Regolini-Galassi. L'exposition comprend des sarcophages et une riche collection de vases grecs, italiens et étrusques. La stèle sépulcrale bilingue de Todi, présentant une double inscription en latin et en gaulois (IIe siècle av. J.-C.), revêt un intérêt particulier.

Musée égyptien grégorien - Conçu par le père Ungarelli, l'un des premiers égyptologues italiens, il rassemble une série de statues représentant des divinités ou des personnalités de la famille royale, telles que la mère et sœur de Ramsès Deux, des sarcophages, des momies et des éléments de mobilier funéraire. La décoration de la statue du serapeum de la Villa Adriana à Tivoli a également été reconstruite.

Musée Grégorien Profane - Il expose des sculptures grecques et romaines telles que trois fragments du Parthénon à Athènes, la tête d'Athéna (460 av. J.-C.), l'autel du vicomagistri (Ier siècle). J.-C.) et deux grands reliefs représentant l’arrivée de Vespasian à Rome et le départ de Domitien. Il comprend également des sarcophages ornés de sujets mythologiques. Le groupe d’Athéna et de Marsia se distingue des copies en bronze.

Musée des Pieux Chrétiens - Il rassemble des matériaux provenant des fouilles des catacombes romaines, plusieurs sarcophages (IIIe-Ve siècle après J.-C.), dont l'un est une copie du sarcophage de Junius Bassus et la statue du Bon Pasteur (IIIème siècle après JC).

Musée missionnaire ethnologique - Il documente les événements religieux et les cultes d'autres continents. Les sculptures aztèques du XVe siècle, les sculptures indiennes de dieux hindouistes et les masques rituels d’Océanie et d’Afrique sont particulièrement intéressants.

Collection d'art religieux moderne - En partie aménagé dans les pièces de l'appartement Borgia, décoré par Pinturicchio, il expose des œuvres de Rosai, Boccioni, Balla, De Chirico, Guttuso et Manzù.

Galeries supérieures - La Galerie du Candélabre rassemble des matériaux archéologiques de l'époque romaine, tels que le groupe de sculptures de Ganymède et de l'Aigle (deuxième siècle après JC) et la statue d'Artémis. La galerie des tapisseries expose des tapisseries de fabrication flamande du XVIe siècle et romaine du XVIIe siècle. La Galerie des cartes géographiques présente 40 panneaux consacrés au territoire italien réalisés entre 1580 et 1583.

Musée de la Bibliothèque du Vatican - Il abrite plusieurs témoignages d'art sacré: la salle des Aldobrandini Mariage avec des fresques de l'époque romaine, la salle des papyrus avec des verres dorés du début de l'ère chrétienne , la salle Sixtine avec des fresques de Cesare Nebbia et d'autres artistes, les salles Pauline, la salle Alexandrine et la galerie Clémentine avec des croquis de Bernini